原标题：脊索瘤医治新办法，针对靶向EGFR和Brachyury
脊索瘤是稀有的骨肿瘤，没有经过同意的医治。这些肿瘤表达几种活化的酪氨酸激酶受体，这促进人们测验用酪氨酸激酶按捺剂医治患者。虽然在运用伊马替尼和索拉非尼的II期临床试验中查询到临床好处，而且偶然也运用EGFR按捺剂，但迄今为止评价的疗法显现出适度的活性。为了承认对脊索瘤患者具有直接医治潜力的新药物，咱们搜集了临床同意的药物和MET，PDGFRβ和EGFR酪氨酸激酶的其他先进按捺剂，并评价了它们对一组脊索瘤细胞系的抗增殖活性。脊索瘤细胞系对MET和PDGFRβ按捺剂无反响。U-CH1和UM-Chor1对一切EGFR按捺剂都很灵敏，而其他的细胞系一般对这些药物不灵敏。Afatinib是仅有一种在脊索瘤组中具有活性的EGFR按捺剂。然后咱们研讨了查询到的反响背面的分子机制，发现了抗增殖IC50秒与afatinib促进EGFR和brachyury降解的共同才能相关，胚胎转录因子被以为是脊索瘤的要害驱动要素。Afatinib 在体内对U-CH1，SF8894，CF322和CF365脊索瘤肿瘤模型显现出有用的抗肿瘤效能。在剖析的小组中，高EGFR磷酸化和低AXL和STK33表达与对afatinib的更高灵敏性相关，而且作为反响的潜在生物标志物值得进一步研讨。这些数据支撑afatinib在临床试验中的运用，并为行将进行的欧洲II期晚期脊索瘤患者afatinib研讨奠定了根底。
脊索瘤是沿轴向骨骼发作的原发性恶性骨肿瘤，一般在骶骨或颅底，但在移动脊柱中也是低频率。脊索瘤是稀有的肿瘤，发病率低于1：1,000,000，占一切原发性骨恶性肿瘤的1％至4％。它们一般是迟发性肿瘤，在生命的第五和第六十年之间具有顶峰发病率，但也可以在儿童和年青成人中发作。
脊索瘤是缓慢成长的肿瘤，但即便在原发肿瘤彻底手术切除后也具有高复发率的特征。远处搬运发作在20％至30％的病例中，但部分复发影响> 50％的患者。在复发的情况下，手术或放射医治变得具有挑战性，而且患者一般死于其疾病。由于这些肿瘤沿着神经轴定位，患者一般会呈现身体功能障碍和需求吗啡衍生物和类固醇的显着痛苦。现在没有规范的药物医治，而且脊索瘤对细胞毒性化疗具有抗性。
脊索瘤起源于胚胎脊索剩下，其特征在于“ T ”基因产品“brachyury” 的表达，“brachyury”是一种脊索特异性转录因子，关于发育过程中的中胚层特化和分解是必需的。成人脊索剩下的brachyury的反常表达被以为在脊索瘤的发作和保持中起首要效果。脊索瘤细胞系中的Brachyury缄默沉静显现危害细胞增殖并诱导变老，现在正在测验经过疫苗靶向表达brachyury的细胞。多项研讨标明，脊索瘤一般体现出酪氨酸激酶受体和下流信号分子的表达和活化，其间MET（HGF受体），PDGFRβ（PDGFRB）和EGFR是最广泛表达的，HER2（ERBB2），KIT（SCFR）和VEGFR（KDR）也标明。
针对EGFR和PDGFR的临床同意药物的可用性促进在挑选用于表达相应药物靶标的脊索瘤患者的II期临床试验中评价伊马替尼和拉帕替尼。伊马替尼显现出一些临床好处，虽然没有完成维度和耐久反响，而拉帕替尼没有显现真实的临床好处。可是，现已报导了对其他EGFR按捺剂的轶事反响，标明EGFR按捺剂或许具有这些肿瘤的医治潜力。最近，依据体外，在脊索瘤进步行了索拉非尼的II期临床试验该药物对VEGFR和PDGFR宗族成员的活性。在该研讨中，未挑选或表征患者的相应受体的表达。值得注意的是，与伊马替尼比较，索拉非尼实际上完成了更长的无发展生存期。
曩昔，由于缺少生物模型，用于判定脊索瘤中活性药物的系统性临床前研讨受到限制，由于U-CH1和U-CH2细胞系代表了仅有的两种可用的经验证的脊索瘤细胞系。最近，经过脊索瘤基金会（一家患者倡议安排（itinib，rociletinib（CO-1686），osimertinib（AZD-9291），拉帕替尼（Tykerb）和PHA-665752购自MedChem Express。
经过LC-HRMS剖析和1 H-NMR 承认化合物的同一性和纯度。将化合物溶于100％10mmol / L DMSO溶液中，并在-20℃的受控气氛下贮存。经过在DMSO中接连稀释制备一切化合物作业原液，然后以1：1,000稀释到细胞培育基中，在一切孔中到达0.1％的终究DMSO浓度。
评价化合物的抗增殖活性
在处理前24小时，将细胞以3,600个细胞/孔接种在384孔白色通明底板（Greiner）中。参加化合物（一式两份，6个稀释点），将细胞再培育144小时。细胞裂解后，经过定量ATP含量承认细胞生机（CellTiter-Glo测定，Promega运用Envision仪器，PerkinElmer）。经过运用S形拟合算法比较处理数据与对照数据来核算按捺活性（IC 50）。
评价化合物的效果机理
在处理前48小时，将指数成长的细胞（0.4×10 6）接种在60mm平板中。将化合物参加培育基中并将板孵育指定的时刻。然后用严寒的PBS洗刷细胞两次，并在RIPA缓冲液（50mmol / L Hepes，pH 7.5,150mmol / L NaCl，1％TritonX-100,1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，10mmol / L）中裂解。 EDTA，蛋白酶按捺剂混合物（Sigma; P8340），以及磷酸酶按捺剂合剂I和II（Sigma公司; P2850和P5725）将裂解物经过离心在16,000xg弄清10分钟。克，在4％的分级别离样品（20微克每个），以12％SDS-PAGE，搬运到硝酸纤维素膜上（Whatman-Protan; 10401196）。用含有5％牛奶和0.1％吐温20的TBS 1X（Biorad）中所述抗体进行免疫印迹。
RT-qPCR剖析
依照制造商的程序，依照RNeasy Mini Kit（Qiagen）提取RNA。运用Nanodrop 1000（Thermo Scientific）经过260nm UV吸收和260/280和260/230比率评价RNA产率和纯度。运用TaqMan Reverse Tranion Reagents（Applied Biosystems / Life Technologies）和随机六聚体引发对RNA进行逆转录。运用SYBR Green技能，运用来自Applied Biosystems / Life Technologies的试剂和资料，在ABI Prism 7900HT Applied Biosystems Sequence Detector（Life Technologies）上经过实时qPCR一式两份地测定每个样品（10-12ng cDNA）12.5μL反响。 （Power SYBR Green PCR Master Mix）。靶特异性和内源性参照对照（GUSB，PPIA，18S rRNA）引物（300nmol / L）胪陈于下表中。表达水平的相对定量核算继ΔΔC 吨办法（Livak; Applied Biosystems公司序列检测用户布告2，https://）。一切程序均依照制造商的阐明进行。
引物序列：
EGFR：fw 5'-AAGTCCCCCAGTGACTGCT-3'，rev 5'-TGGCTTCGTCTCGGAATTT-3'
T -brachyury：fw 5'-GTATGAGCCTCGAATCCACAT-3'，rev 5'-GATAAGCAGTCACCGCTATGAA-3';
STK33：fw 5'-CGACTATAGCCAGCAGTGTGA-3'，rev 5'-TCTCTTCTGAGCTTGCCAAA-3';
AXL：fw 5'-CACCTCCCTGCAGCTTTC-3'，rev 5'-CTCCAGCCCAACATAGCC-3';
GUSB：fw 5'-GCATCCAAAAGACGCACTTC-3'，rev 5'-CACCCACCACCTACATCGAT-3';
PPIA：fw 5'-CCCACCGTGTTCTTCGACAT-3'，rev 5'-TTTCTGCTGTCTTTGGGACCTT-3';
18S rRNA：fw 5'-AGCTGGAATTACCGCGG-3'，rev 5'-TGACGAAAAATAACAATACAGGACTC-3'。
体内研讨
依据世界动物护理和运用委员会同意的计划，经过南德克萨斯加快研讨医治学（START）的脊索瘤基金会药物挑选管道进行临床前研讨。
在以下方面测验抗肿瘤活性：
- U-CH1： U-CH1细胞系的异种移植物。
- SF8894： PDX类型。
- CF322：由42岁男性的复发性肿瘤发作的新脊索瘤PDX模型。
- CF365：新的脊索瘤PDX模型，由11岁男性患者的低分解搬运性肿瘤发作。
关于一切模型，将6至8周龄的无胸腺裸鼠（Charles River Labs）皮下植入来自宿主动物的肿瘤碎片。一旦肿瘤到达约150至250mm 3，经过肿瘤体积（TV）匹配动物并随机分配至对照组和医治组。一切组每天以20mg / kg PO，U-CH1和SF9984组给药28天，而且CF322和CF365组完毕。在第0天开端初始给药。每天查询动物并每周称重两次。运用数字卡尺和刻度以电子办法搜集电视和动物体重数据; 运用公式TV（mm 3）=宽度2（mm 2）将肿瘤尺度转换为体积）×长度（mm）×0.52。端点是约1至2cm 3的均匀对照电视。运用初始和终究肿瘤丈量核算并陈述医治比照组的肿瘤成长按捺百分比值。运用双要素ANOVA进行统计剖析，然后进行Dunnett多重比较查验。
EGFR免疫沉淀
将细胞在1X细胞裂解缓冲液CLB（20mmol / L TRIS，pH 7.5,150mmol / L NaCl，1mmol / L EDTA，1mmol / L EGTA，1％Triton X-100，蛋白酶和磷酸酶按捺剂混合物中）裂解 - EZBlock蛋白酶按捺剂鸡尾酒不含EDTA的BV-K272，EZBlock磷酸酶按捺剂鸡尾酒II，BV-K275-1EAEZ，Block Phosphatase Inhibitor Cocktail III，BV-K276-1EA-Vinci-Biochem）。
将蛋白G Sepharose 4快速活动（17-0618; GE Healthcare）用严寒的PBS洗刷4次，预先加载PBS / TritonX-100中的抗EGFR抗体（Santa Cruz Biotechnology sc-03）并在温文摇摆下孵育过夜。 4℃。
经过用蛋白G琼脂糖凝胶在4℃下摇摆20分钟来预清洗细胞裂解物，预先用严寒的PBS洗刷4X，用CLB缓冲液洗刷1次。
将预加载的树脂/抗体在4℃下与细胞裂解物一同摇摆3小时。将样品搬运到细胞离心涂片（CytoSignal cat.C00-100）上，用CLB缓冲液洗刷3次，并在95℃下在Laemmli-SDS缓冲液2X中洗脱。
成果
咱们组装了一组脊索瘤细胞系，包含骶骨来历的细胞，如广泛运用的U-CH1和U-CH2，最近树立的MUG-Chor1和JHC7，以及第一个可用的clival细胞系UM-Chor1。此外，咱们测验了Chor-IN-1，一种来自骶骨脊索瘤手术样本的新细胞系，显现契合脊索瘤细胞系的验证规范。首要经过STR指纹辨认一切细胞系。从两个来历取得的U-CH2细胞的STR谱在单个基因座处不同，标明在它们的繁衍期间取得的差异很小（弥补表S1）。因而，两个克隆平行测验。
免疫印迹剖析显现，一切7种细胞系均表达“ T ”基因产品brachyury，被以为是脊索瘤的界说标志物（图1）。
图1。脊索瘤细胞系中酪氨酸激酶受体和其他信号分子的免疫印迹剖析。U-CH1，U-CH2，UM-Chor1，Chor-IN-1，MUG-Chor1和JHC7蛋白质细胞提取物的免疫印迹剖析在SDS-PAGE凝胶上别离，搬运到硝酸纤维素膜上，并用指定的抗体勘探。
显现MET和EGFR在不同细胞系中显现类似的表达水平，而且简直检测不到HER2。PDGFRβ表达愈加异质，规模从十分低（U-CH1）到高表达（U-CH2和UM-Chor1）。下流信号分子AKT（PKB），MAPK（MAPK1 / MAPK3）和STAT3在不同细胞系中差异激活，与受体表达无特异性相关（图1）。
为了评价这些酪氨酸激酶受体对脊索瘤细胞成长的重要性，咱们组装了一系列有用的MET，PDGFRβ和EGFR按捺剂，包含同意的药物以及其他参阅按捺剂。考虑到脊索瘤细胞的缓慢成长速率（> 60小时倍增时刻），在孵育144小时后测定化合物的抗增殖活性，以答应两次集体倍增。一起，在参阅细胞系上剖析按捺剂：具有MET扩增的胃腺癌MKN-45 ，具有PDGFRA扩增的NSCLC NCI-H1703和具有EGFR的表皮样癌A431。 扩增用作阳性对照，而卵巢癌A2780细胞系用作一般阴性对照，其预期没有靶依靠性活性。
Crizotinib和cabozantinib，两种经同意的MET按捺剂药物和MET挑选性按捺剂PHA-665752对脊索瘤细胞系没有显着的抗增殖活性，IC 50高于那些丈量A2780对照细胞系（弥补表S2A）。
用几种PDGFR按捺剂，包含同意的药物舒尼替尼和伊马替尼（查询到类似的成果）以及克莱拉尼（参阅40 ;弥补表S2B）。
然后咱们测验了临床上同意的EGFR按捺剂药物厄洛替尼，吉非替尼，阿法替尼和拉帕替尼，它们在EGFR / HER2宗族中具有不同的效能和挑选性。一切化合物对U-CH1和UM-Chor1细胞系均有活性，但具有不同的效能。特别地，阿法替尼对两种细胞系都十分有用，IC 50分别为0.014和0.023μmol/ L，而其他三种药物在0.1-0.8μmol/ L规模内体现出IC 50 s。此外，afatinib是仅有显现活性的药物，虽然具有不同的效能，但对一切细胞系都有用（IC 50<0.7μmol/ L），JHC7在外。其他EGFR按捺剂厄洛替尼，拉帕替尼和吉非替尼虽然对亚微摩尔规模内的U-CH1和UM-Chor1具有活性，但一般对其他脊索瘤细胞系没有显着的抗增殖活性。
EGFR按捺剂在脊索瘤细胞系中的抗增殖活性
为了研讨这些成果是否与阿法替尼的EGFR按捺的效能和/或共价机制相关，咱们还测验了共价EGFR按捺剂奈拉替尼和达克替尼。两者均在纳摩尔规模内按捺U-CH1和UM-Chor1，但在其他细胞系上具有差的活性，具有与A2780对照细胞系查询到的IC 50适当或更高的IC 50。
风趣的是，dacomitinib 在U-CH1和UM- Chor1中显现出与阿法替尼适当的IC 50值，但在其他细胞系中一般不具有活性，因而标明阿法替尼在脊索瘤组中的活性不只与其对立其生物化学效能有关。 EGFR。值得注意的是，T790M EGFR骤变型挑选性共价按捺剂osimertinib（AZD-9291）和rociletinib在一切脊索瘤细胞系中无活性或活性差，正如预期的EGFR骤变缺失所预期的那样。
这些数据标明阿法替尼对脊索瘤的抗增殖效果与EGFR按捺有关，但不只与其效能或共价效果机制有关。
为了取得用阿法替尼医治诱导的效应的动态查询，咱们运用多孔主动显微镜（IncuCyte ZOOM）进行动力学活细胞剖析（拜见弥补办法）。用阿法替尼或阿霉素规范品处理U-CH1细胞，并发作延时电影，整合经过144小时处理取得的活细胞图画序列。跟着阿法替尼或阿霉素浓度的添加，细胞集合跟着时刻的推移逐步下降，而在未处理的细胞中则添加（弥补图S1A）。在活性化合物浓度下，图表以布景信号为根底，标明细胞碎片的图画剖析。相反，用特定荧光染料丈量的半胱天冬酶3（CASP-3）和半胱天冬酶7（CASP-7）诱导（弥补办法）在多柔比星处理后是显着的，但用阿法替尼医治后未检测到（弥补图S1B和S1C）。该试验证明阿法替尼按捺U-CH1细胞增殖并以时刻和剂量依靠性办法诱导细胞逝世，并标明细胞逝世的首要机制不是细胞凋亡。
然后，咱们研讨了在U-CH1细胞顶用阿法替尼，厄洛替尼或拉帕替尼医治后的剂量和时刻依靠性生物标志物调理，对一切EGFR按捺剂有反响（图2）。AKT和MAPK途径由三个按捺剂以剂量依靠的办法调制的，经过短（24年2月8日小时），延伸（48小时）的温育时刻，在剂量的抗增殖IC共同既50秒。相反，STAT3活化不依靠于这些细胞中的EGFR信号传导。在48小时内未查询到Caspase 3裂解，这再次标明除了凋亡之外的机制参加这些按捺剂的抗增殖效果（图2）; 弥补图S1B）。风趣的是，用阿法替尼和厄洛替尼医治诱导LC3B（MAP1LC3B）的细胞质和膜结合办法的总水平下降，暗示或许触及自噬途径。
图2。用不同EGFR按捺剂处理U-CH1细胞系时的生物标志物调理。用指定剂量的按捺剂处理的U-CH1细胞的免疫印迹剖析2-8-24小时（上）或48小时（下）。在SDS-PAGE凝胶上别离蛋白质细胞提取物，并用指定的抗体勘探膜。报导了IC 50的不同按捺剂。
三种化合物效果机制的显着差异是最近时刻点对brachyury和EGFR蛋白水平的影响。培育48小时后，afatinib不只诱导EGFR总水平的激烈下降，而且还诱导了brachyury蛋白的剂量依靠性下降。查询到EGFR耗费，但在厄洛替尼医治后仅有较小程度，而且在用拉帕替尼医治后不存在。用厄洛替尼或拉帕替尼医治不影响Brachyury表达。
为了评价afatinib诱导的EGFR和brachyury下调是否与更强的效能或共价按捺机制相关，咱们剖析了dacomitinib的效果，其在U-CH1和UM-Chor1上显现类似的IC 50，但一般在其他细胞系。用dacomitinib处理U-CH1细胞诱导剂量依靠性下调P-AKT水平，但与afatinib不同，不影响EGFR和brachyury的总水平高达5μmol/ L（弥补图S2）。这些数据支撑这样的假定：阿法替尼对脊索瘤细胞系查询到的活性或许与其融化与脊索瘤细胞成长相关的两种蛋白质的才能有关，而不只仅与其对EGFR按捺的效能或共价机制有关。
为了研讨这种特定机制是否也发作在其他阿法替尼反响性脊索瘤细胞系中，用化合物处理MUG-Chor1和Chor-IN-1并经过免疫印迹剖析。图3显现EGFR和brachyury的下调在每个细胞系内以相同的剂量 - 反响办法发作，其与丈量的IC 50s相关。因而，阿法替尼是仅有显现活性的EGFR按捺剂，虽然具有不同的效能，但跨过脊索瘤细胞系组，而且仅有的按捺剂诱导已知在脊索瘤细胞成长中起首要效果的两种生物标志物的下调。
图3。用阿法替尼处理U-CH1，MUG-Chor1和Chor-IN-1细胞系时的生物标志物调理。用阿法替尼处理的U-CH1，MUG-Chor1和Chor-IN-1细胞的免疫印迹剖析2-8-24或48小时。在SDS-PAGE凝胶上别离蛋白质细胞提取物，并用指定的抗体勘探膜。陈述了每种细胞系的IC 50。
为了探究EGFR和brachyury之间的潜在相关性，剖析了它们对siRNA的相互影响（弥补办法）。用特异性siRNA寡核苷酸转染U-CH1细胞诱导相应靶蛋白（EGFR或brachyury）的彻底融化，而对其他蛋白没有影响。在两种情况下，查询到细胞生机的激烈危害，因而证明brachyury和EGFR在脊索瘤细胞成长中起要害效果（弥补图S3A和S3B）。咱们排除了这种下调发作转录，由于用0.1和1μmol/ L afatinib处理U-CH1细胞24或48小时不影响brachyury mRNA而且仅稍微下降EGFR mRNA（弥补图S4A）。
相反，在MG-132（蛋白酶体按捺剂）或巴弗洛霉素（自噬按捺剂）存鄙人用阿法替尼医治U-CH1细胞阻挠了afatinib诱导的EGFR和brachyury蛋白融化（弥补图S4B），因而标明这些下调。蛋白质触及蛋白质降解的途径。
然后，咱们在U-CH1异种移植物和SF8894，CF322和CF365 PDX（29）小鼠模型中评价体内阿法替尼的活性，如资料和办法部分中所述发作。在一切剖析的模型中，用20mg / kg阿法替尼每天口服医治小鼠在一切剖析的模型中诱导有用的肿瘤成长按捺，没有显着的毒性痕迹（图4）。这些数据证明，afatinib 在体外查询到的活性在四种模型中的四种中转化为令人形象深入的体内成效，为在临床中测验该药物供给了强有力的理论依据。
图4。阿法替尼对U-CH1异种移植物和不同PDX模型的体内成效。如图所示，每天给予带着U-CH1或SF8894，CF322和CF365肿瘤的裸鼠与阿法替尼20mg / kg口服给药28天（条形标明医治时刻）或至医治完毕。
最终，咱们运用对afatinib具有不同水平反响的细胞系开端探究对该药物灵敏的潜在生物标志物。咱们查询是否在IC的差异50这些细胞系中小号或许与总EGFR水平，受体激活的程度或以差分对按捺剂的呼应。发现总的和膜结合的EGFR水平在不同的脊索瘤细胞系中是适当的，如经过用西妥昔单抗的流式细胞术剖析所检测的（弥补办法;弥补图S5A）。
在根底条件下和用阿法替尼处理后，经过从总细胞裂解物中免疫沉淀受体，然后用抗-P-Tyr抗体进行免疫印迹，剖析EGFR磷酸化水平。图5A显现EGFR从一切细胞裂解物（底部）有用免疫沉淀，而且灵敏细胞系含有磷酸化EGFR（上图），而JHC7具有最低水平的根底磷酸化。风趣的是，用afatinib医治诱导U-CH1细胞系彻底EGFR去磷酸化，但没有减少JHC7中检测到的弱P-Tyr条带（图5A）， 最佳）。由于用afatinib医治也彻底消除了MUG-Chor1，Chor-IN-1和U-CH2细胞系中的EGFR磷酸化（弥补图S5B），在JHC7中查询到的条带或许是由于辨认不同的磷酸化位点，而不是与受体激活有关。因而，脊索瘤细胞系对阿法替尼的灵敏性好像一般与EGFR磷酸化相关，而且JHC7细胞系中缺少EGFR活化或许是所丈量的更高IC 50的原因。
图5。判定对阿法替尼灵敏的潜在决定要素。A，不同脊索瘤细胞系中EGFR磷酸化的免疫沉淀剖析。如所示，用来自未处理或阿法替尼处理的细胞系的抗EGFR抗体免疫沉淀受体。在SDS-PAGE凝胶上别离免疫复合物。运用抗EGFR或抗P-Tyr抗体勘探膜。B， AXL和STK33在不同脊索瘤细胞系中的表达。上图：AXL表达的免疫印迹剖析。在SDS-PAGE凝胶上别离蛋白质细胞提取物，并用抗AXL抗体勘探膜。下图：如所述，将STK33mRNA表达的RT-qPCR剖析归一化至参照对照。依据阿法替尼灵敏性排序对细胞系进行排序。
为了承认对阿法替尼不同灵敏性的其他潜在决定要素，咱们剖析了AXL的表达，据报导它可以介导不同肿瘤类型对立EGFR疗法的抗性。图5B显现AXL表达与对afatinib的灵敏性成反比相关，在U-CH1和UM-Chor1细胞系中表达较弱，在较不灵敏的MUG-Chor1，U-CH2和Chor-IN-1细胞中表达较高。线。在JHC7中未查询到AXL的表达，其间EGFR途径未被激活。
风趣的是，在整个激酶组靶向测序中，平行评价U-CH1中约500种激酶与其他骶骨脊索瘤细胞系的差异表达，STK33成为仅有在U-CH1中检测不到的激酶，而且在U-CH1中具有更高的表达。其他细胞系。然后咱们经过RT-qPCR评价一切细胞系中的STK33表达，而且发现在阿法替尼高反响性U-CH1和UM-Chor1细胞系中均未表达，而在其他细胞系中承认相关表达。
最终，咱们进行了一项药效学研讨，评价了用阿法替尼医治U-CH1，MUG-Chor1和Chor-IN-1细胞系1小时和2小时后的EGFR信号以及AXL和STK33水平。未检测到AXL和STK33 mRNA或总蛋白水平的相关改动（弥补图S6A和S6B）。风趣的是，虽然在0.1μmol/ L afatinib的一切细胞系中EGFR磷酸化被废弃，可是在U-CH1细胞系中P-AKT被封闭，但在MUG-Chor1和Chor-IN-1中显现出细微的添加趋势（弥补图.S6B和S6C），着重阿法替尼在这些细胞系中的活性是由超出EGFR激酶按捺的细胞机制所奉献的。
评论
到现在为止，仅进行了一些临床试验来评价靶向医治剂在脊索瘤中的成效，当然受限于现在可用的该适应症的临床前模型的数量。咱们最近在基因组水平上深入剖析了一组骶骨来历的脊索瘤细胞系，其间还包含在咱们的试验室中树立和表征的新细胞系Chor-IN-1。为了承认或许对脊索瘤患者有直接医治运用的新药物，咱们评价了MET，PDGFRβ和EGFR酪氨酸激酶按捺剂的体外抗增殖活性，据报导它们经常在脊索瘤中表达。
MET按捺剂没有显现出显着的活性，也没有进一步研讨。即便在具有PDGFRβ强表达的细胞系如U-CH2和UM-Chor1中，PDGFR按捺剂也没有活性。考虑到伊马替尼的II期临床试验显现脊索瘤患者具有必定的临床好处，PDGFRβ在肿瘤微环境中的按捺效果或许导致体外肿瘤细胞仅具有抗增殖活性的效果，或许肿瘤中的PDGFRβ或许被旁排泄机制激活。在体外丢掉。风趣的是，在临床中查询到的对伊马替尼的反响首要与肿瘤特征的改变而不是维度有关。
文献中的多篇报导着重了不同EGFR按捺剂在脊索瘤细胞系，动物模型中的活性，以及偶发性患者，供给了EGFR按捺剂在脊索瘤中潜在临床相关性的依据，可是也提出了关于最合适的代理人的问题。
咱们将研讨要点放在临床同意的EGFR按捺剂上，并查询到它们都显现出一些活性，虽然它们具有不同的效能，但对U-CH1和UM-Chor1细胞系有用。阿法替尼是这些细胞系中最有用的按捺剂，而拉帕替尼除了在剩下的细胞系中无活性外，其活性最低，这或许预示着拉帕替尼在临床中查询到的活性较差。除了JHC7之外，Afatinib也是仅有具有跨过脊索瘤细胞系组活性的药物，虽然表达显着水平的EGFR不是由EGFR信号传导驱动的。
阿托替尼在脊索瘤细胞系中的活性特别相关，由于该药物在生物化学上具有十分高的挑选性，其细胞活性依靠于EGFR途径的激活。以U-CH1和UM-CHOR1脊索瘤细胞系阿法的活性等同于所报导的骤变EGFR依靠性肺肿瘤在体外，这标明脊索瘤也或许代表这种药物潜在的指示。
这些细胞数据还经过令人形象深入的体内成效证明，在一种脊索瘤异种移植物和三种不同的PDX模型中具有肿瘤成长按捺。
Scheipl及其搭档宣布了一篇要点化合物挑选，描绘了EGFR按捺剂在一部分脊索瘤细胞系中的活性，依据咱们的数据报导，U-CH1和UM-Chor1细胞系对EGFR按捺剂灵敏，但他们意外地发现afatinib对UM-Chor1有活性，但在U-CH1细胞系中没有。考虑到咱们在体外重复查询阿法替尼对U-CH1的有用活性，调理下流途径，特别是体内，他们在U-CH1中查询到的缺少活性或许与不同的挑选条件或化合物处理有关。
与作为可逆按捺剂的厄洛替尼，吉非替尼和拉帕替尼不同，阿法替尼含有可以在EGFR（Cys797），HER2（Cys805）和HER4（Cys803）的催化结构域内保存半胱氨酸迈克尔加成的亲电子基团，诱导彻底和长时间按捺受体磷酸化。可是，afatinib在脊索瘤细胞系中的活性好像不只与其更高的效能和共价机制有关，由于同享相同机制的neratinib和dacomitinib仅在U-CH1和UM-Chor1细胞系中有活性。
这项活动好像是由其下调EGFR和brachyury蛋白总水平的共同才能所激烈奉献的，这是其他按捺剂所不具备的特征。风趣的是，最近显现afatinib诱导从用阿法替尼处理的NCI-N87异种移植物收成的肿瘤中HER2和EGFR的总水平的下调。
Brachyury是散发性脊索瘤的共同标志物，T基因位点的重复是宗族性脊索瘤的典型体现，T基因中的DNA多态性与一般人群中的脊索瘤易理性相关。因而，广泛显现脊索瘤细胞系中brachyury的缄默沉静在体外和体内均危害肿瘤成长（弥补图S3B）。Brachyury将代表脊索瘤药物开发的显着靶标，但迄今为止，用小分子直接按捺转录因子具有极大的挑战性。
除按捺EGFR信号传导外，小分子的判定诱导了brachyury降解，这代表了一种用激酶按捺剂直接靶向这种重要转录因子的新办法。
整体而言，在不同细胞系和体内模型中测验EGFR按捺剂标明脊索瘤的一个子集由EGFR信号传导途径驱动，而且对EGFR按捺具有惊人的灵敏性。临床前，这种灵敏性与EGFR磷酸化水平相关，评价临床研讨中是否适用这一点十分重要。风趣的是，Mug-Chor1，U-CH2和Chor-IN-1脊索瘤细胞系显现出激烈的AXL受体表达，值得进一步研讨，由于它代表了肺癌的耐药机制。假如这也发作在脊索瘤中，现已在临床中的AXL按捺剂的联合医治或许对这些类型的患者有利。STK33在对阿法替尼最灵敏的细胞系中不存在，也代表阿法替尼灵敏性的候选生物标志物，值得进一步研讨。
这些数据为正确评价afatinib医治脊索瘤患者供给了强有力的理论依据。因而，关于晚期脊索瘤中阿法替尼的欧洲II期研讨行将开端招募患者。
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